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Aislamiento, clonación y producción de una enzima Lipolítica de Natronococcus SP. TC6, a partir de una librería genómica

José Alberto López Barrera, Celso Córtes, Rosa M. Camacho Ruíz, Heykel Trabelsi, Jacques Baratti, Jesús Córdova

Resumen


Los procesos biotecnológicos e industriales demandan de biocatalizadores robustos. Para conseguir este atributo, se recurre a la búsqueda de enzimas de microorganismos que naturalmente se han adaptado a ambientes inhóspitos. La generación de bibliotecas genómicas y el análisis genómico son herramientas moleculares poderosas para descubrir biomoléculas con características únicas y sobresalientes. Empleando el genoma fragmentado mecánicamente de un arquea halófila, Natronococcus sp. TC6, se construyó una genoteca de cósmidos, los cuales fueron usados para transformar a la cepa E. coli. En total, fueron generados 2181 clones, de los cuales, se seleccionaron seis con actividad lipolítica, ya que hidrolizaron ésteres de pNitrofenilo como sustratos, en un medio de reacción conteniendo 2.5 M de NaCl. Las clonas que hidrolizaron ambos sustratos (clonas positivas) fueron aisladas y los cósmidos fueron purificados y fragmentados para posteriores análisis enzimáticos. Los fragmentos de DNA de las clonas positivas, fueron subclonados y secuenciados. El análisis bioinformático de las secuencias obtenidas permitió identificar una tioesterasa putativa, la cual fue ligada en un vector de expresión, y éste utilizado para su introducción en células de E. coli BL21 para la producción de la proteína recombinante. La tioesterasa identificada posee 158 aminoácidos con un peso molecular de 15.4 kDa y con una similitud del 99% con el gene de la bacteria Stenotrophomonas maltophilia.  La tioesterasa putativa de Natronococcus sp. TC6, presenta tres sitios altamente conservados como en S. maltophilia, posee dos motivos cercanos al extremo N-terminal, GHVNN y YXEXAR. También presenta una variante del pentapéptido involucrado en el sitio activo y característico de la mayoría de las éster hidrolasas, GXSXV. 


Palabras clave


Biblioteca genómica; tioesterasa; Arquea halófila; Natronococcus

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